Antifryseproteiner hjælper planter og dyr med kuldetolerance

Når jeg går tur ude på landet, hvor jeg bor, noterer jeg mig ikke sjældent, at visse planter står smukt grønne i selv ret hård frost og med is på bladende. Især vinterraps, erantis og vintergækker.

Hver gang jeg ser disse planter, tænker jeg ”man burde måske også lige kigge på deres kuldetolerance”.

Planter er imidlertid ikke min spidskompetence, da jeg er dyrefysiolog med speciale i vekselvarme dyrs fysiologiske tilpasninger til kulde og tørke. Men det viser sig hurtigt ved en gennemgang af litteraturen, at planter har en del tilpasninger til kulde fælles med dyr – mere om det senere.

Dyr tåler isdannelse i væv

Vekselvarme dyr, der udsættes for temperaturer under deres kropsvæskers ligevægtsfrysepunkt (smeltepunkt) er i fare for, at der bliver dannet is i kropsvæskerne, både ekstra- og intracellulært.

Disse dyr har udviklet en række tilpasninger, der gør dem i stand til at overleve de lave temperaturer – nogle dyr ned til temperaturer under -60 °C!

Overordnet deler man dyrene op i to grupper alt efter deres evolutionære strategi til at håndtere de lave temperaturer:

• Frysetolerance, hvor dyrene tåler isdannelse i vævene, oftest ekstracellulært.
• Fryseundvigelse, hvor dyrene overlever de lave temperaturer i en underafkølet tilstand. Her er deres kropsvæsker flydende, og isdannelse vil være dødelig.

Frysetolerante dyr tåler, at op til 85 pct. af deres kropsvæske omdannes til is, bl.a. det new zealandske insekt den alpine weta, Hemideina maori.

Alle kuldetolerante vekselvarme organismer har udviklet specielle tilpasninger til lave temperaturer. Disse omfatter både syntese af lavmolekylære stoffer og makromolekyler samt ændringer i sammensætningen af de fosfolipider, som cellemembranerne er består af.

Aminosyrer, sukre og polyoler som antifrostvæske

Både frysetolerante og fryseundvigende dyr syntetiserer lavmolekylære kryoprotektiver (frysebeskyttende stoffer) såsom polyoler (fx glycerol) og sukre (fx sorbitol og trehalose) og aminosyrer.

Kryoprotektiverne interagerer hos begge grupper direkte med membraner og proteiner, hvorved de bibeholder deres oprindelige struktur trods kulden.

Hos de frysetolerante dyr nedsætter de lavmolekylære kryoprotektiver desuden isdannelseshastigheden og ismængden i vævene.

Hos de fryseundvigende dyr virker de lavmolekylære kryoprotektiver i nogen grad som antifrostvæske i en bil. De nedsætter ligevægtsfrysepunktet af opløsningen (kropsvæsken), og det samme gælder for underafkølingspunktet – det er udtryk for en uligevægtstilstand, hvor væsken skulle være frosset, men hvor den pga. aktiveringsenergien for fryseprocessen ikke er det.

Proteiner som igangsættere af isdannelse i frysetolerante dyr

De makromolekylære tilpasninger drejer sig hos frysetolerante dyr især om syntesen af isnukleerende proteiner (INA – Ice Nucleating Agents). Dette er store proteiner eller aggregater af større proteiner, der virker som vækstpunkter for is.

For at is skal kunne dannes i en opløsning, kræver det en vis aktiveringsenergi, og der skal dannes et iskim. INA sænker aktiveringsenergien, da de har en islignende overflade, og iskim bliver dannet ud fra disse overflader.

Igangsætningen af isdannelsen er vigtig for de frysetolerante dyr, idet INA nukleerer isen ved en relativt høj temperatur i ekstracellulærvæsken. Det sikrer, at frysningen sker ekstracellulært, og at isdannelsen sker forholdsvist langsomt.

Isdannelse sker dog ikke altid via syntetiserede proteiner, men også via indvoksning af iskrystaller fra omgivelserne, der kan vokse ind igennem kropsåbninger.

Antifryseproteiner og isbindende proteiner i fryseundvigende dyr

Makromolekylære tilpasninger hos fryseundvigende dyr drejer sig hovedsageligt om syntesen af antifryseproteiner (AFP) eller isbindende proteiner (IBP).

Antifryseproteiner er en relativt nyopdaget gruppe af strukturelt forskellige proteiner, der alle har det tilfælles, at de genkender og binder sig til isoverflader, hvorved de hæmmer væksten af iskrystallerne, så de ikke vokser, når temperaturen falder.

Først når den drivende kraft for isens vækst bliver tilstrækkeligt stor, altså ved en lavere temperatur, begynder iskrystallerne at vokse. Denne temperatur kaldes ’hysteresefrysepunktet’.

AFP’s aktivitet er defineret ved ’antifryseaktiviteten’, som er temperaturforskellen mellem opløsningens frysepunkt (smeltepunkt) og hysteresefrysepunktet.

Antifryseaktiviteten er afhængig af typen og koncentrationen af antifryseprotein i opløsningen. Afhængigt af typen af antifryseproteiner ligger den maksimale antifryseaktivitet på mellem 0,2 °C og 9 °C.

Marine fisk sluger iskrystaller og får dem i tarmsystemet

Antifryseproteiner er kendt fra mange forskellige organismer. De blev først opdaget hos antarktiske fisk, men er siden fundet hos bakterier, alger, insekter, polare og temperere fisk samt højere planter.

Hos fisk er den maksimale antifryseaktivitet ca. 1,5 °C, mens den hos insekter når helt op på 9 °C. Forskellen skyldes, at insekterne udsættes for betragteligt lavere temperaturer end fiskene, som jo aldrig udsættes for mere end -1,9 °C – det er ligevægtsfrysepunktet eller smeltepunktet af oceanisk havvand.

Insekterne har således udviklet betydeligt kraftigere AFP. Udover at hæmme væksten af evt. iskrystaller, der måtte dannes i de fryseundvigende dyr, hæmmer AFP også inokulation af is fra omgivelserne.

Marine fisk, som hele tiden drikker havvand, får ret store mængder iskrystaller ind i tarmsystemet, i hvert fald de antarktiske arter. Hvis der ikke var noget, der hæmmede deres vækst, ville tarm- og kropsvæskerne fryse. Disse fisk har et ligevægtsfrysepunkt på ca. -1,2 °C, men fiskene har samme temperatur som deres omgivelser på -1,9 °C.

Planter tåler is i vævene

I planter finder man ikke høje antifryseaktiviteter, og det vil nok være mere rigtigt at betegne proteinerne her som isbindende proteiner (IBP).

Mange planter er frysetolerante og tåler dermed is i vævene, så rollen af de isbindende proteiner er her formentlig at hæmme rekrystallisering af iskrystaller.

Rekrystallisering består i, at de store iskrystaller vokser på bekostning af de små, hvilket på sigt vil give vævsskader. Det bliver hæmmet af de meget effektive rekrystalliseringshæmmende IBP i de kuldetolerante planter.

AFP hæmmer isvæksten, ved at proteinerne binder sig til bestemte planer på iskrystallerne (genkendelse og binding er kun delvist forstået). På de steder, hvor proteinerne er bundet, kan isen ikke vokse, mens mellem AFP-molekylerne vokser isen i en art halvkugleform.

Når halvkugleformen ved en bestemt temperatur når en vis kurvatur, ophører væksten af isen, da det kemiske potentiale af vandmolekylerne i isen er det samme som det kemiske potentiale af vandmolekylerne i kropsvæsken.

Når insekters AFP er mere aktive, skyldes det, at de binder sig til flere forskellige krystalplaner på iskrystallerne, mens fiske-AFP kun binder til de såkaldte prismeplaner. Den temperatur, hvor de forskellige planer vokser, er pga. termodynamiske forhold forskellig, hvilket altså giver forskellige antifryseaktiviteter.

Insekter danner svovlbroer og giver proteiner styrke

Hos insekter er koncensusstrukturen (de mest almindelige aminosyrer) af de isbindende motiver threonin-alanin-threonin, men der er en meget stor diversitet i strukturen af AFP fra forskellige insektgrupper, hvor denne triplet kan være mere eller mindre gentaget.

De fleste insekt-AFP har desuden ret mange cysteiner (svovlholdige aminosyrer), som parvist danner svovlbroer, der giver proteinerne en relativt stiv struktur, og som er nødvendige for antifryseaktiviteten.

Der er dog AFP fra træbukkearter af slægten Rhagium, der kun har én svovlbro, som skal være dannet, for at der er aktivitet. Disse Rhagium AFP (RmAFP) er vi så heldige at arbejde med på RUC.

Plante-AFP har en langt mindre antifryseaktivitet end dyrenes AFP. Proteinerne har til gengæld en meget stor rekrystallisationshæmning. Dette betyder formentligt, at der derved ikke dannes store sammenhængende iskrystaller i de frysetolerante planter og sprænge vævene.

Giver viden til frysning af fødevarer

Netop hæmning af rekrystallisation er fra et anvendelsesmæssigt synspunkt af stor betydning.

Isen i forskellige fødevarer, som opbevares i frossen tilstand, vil have en tendens til at rekrystallisere, og i fx flødeis tilsættes alle mulige stabilisatorer, fedt m.m. for at imødegå rekrystallisering.

Her er der allerede firmaer, der producerer fiske-AFP og har det i deres portefølje af tilsætningsstoffer til iscreme. Derved kan man skære ned på mængden af fedt og andre stabilisatorer.

I flere andre typer fødevarer vil man med fordel kunne tilsættes AFP for at undgå rekrystallisering, men pga. bl.a. den tekstur, som fiskeantifryseproteiner giver isen, vil disse ikke være hensigtsmæssige i alle sammenhænge.

Metoder til nedkøling af organer og sæd

Det har naturligvis været foreslået at anvende AFP i forskellige medicinaltekniske sammenhænge, og her springer to muligheder i øjnene:

• En mulig stabilisering af den underafkølede tilstand, så man i stedet for at fryse organer ville kunne opbevare dem underafkølede, og altså uden at der er iskrystaller til stede, ved fx -20 °C i lange tidsrum.
  Denne ide er der endnu ikke arbejdet meget med, men den burde helt sikkert tiltrække sig større opmærksomhed.
• Stabilisering af vandige glasser. Når man i dag ‘fryser’ sæd- og ægceller samt ikke mindst embryoner, er det ofte ikke i et almindeligt frossent stadie, men i en såkaldt glastilstand, hvor opløsningen er helt hård som is, men der er ikke iskrystaller til stede.
  Her har det vist sig, at AFP formodentligt kan stabilisere glastilstanden, hvilket er vigtigt især under opvarmningen. Denne problemstilling er vi i gang med at undersøge som et samarbejde mellem fysikere, kemikere og mit laboratorium på RUC.

Bred anvendelse fra katetre og implantater til vindmøller og fly

I en medicinsk sammenhæng er der et område for brugen af AFP, som først lige er begyndt at vise resultater. Det er i forbindelse med bakteriers biofilmdannelse, hvilket er en del af bakteriers måde at inficere andre organismer på.

Præliminære resultater viser, at i hvert fald visse AFP kan hæmme dannelsen af biofilm – et område, som har et meget stort potentiale i forbindelse med katetre, implantater osv.

Et andet anvendelsesområde for AFP kan være udformningen af isafvisende overflader, hvilket ville være enormt praktisk i forbindelse med vindmøllevinger, flyvinger, broer o.lign.

Her er det vist, at AFP kan bindes til bestemte overflader, men det kræver en hel del teknisk udvikling, før vi kan undgå de-icing af flyene om vinteren – det vil spare tid, penge, ressourcer og ikke mindst påvirkning af miljøet.

Ryps er mere kuldetolerant end raps

For at vende tilbage til de grønne planter, som jeg kan observere om vinteren: I Danmark dyrker vi vinterraps, Brassica napus. Denne art syntetiserer ikke AFP, og der er store problemer med at dyrke den nordligere end i Danmark.

I vores nordligere nabolande dyrkes en anden art af samme slægt, Brassica rapa, også kaldet Ryps på dansk. Brassica rapa er tilsyneladende bedre kuldetilpasset og syntetiserer AFP. Men man vil gerne dyrke B. napus nordligere end Danmark.

Da de to plantearter er nært beslægtede, er det jo nærliggende at tænke sig, at det skulle være muligt at overføre genet fra B. rapa til B. napus og dermed lave en kuldetolerant rekombinant (gensplejset) variation af B. napus. Dette er ikke gjort endnu, men der er givetvis laboratorier i fx Kina, som er i gang med denne type forskning.

Det er muligt at overføre AFP-gener fra fx insekter til bl.a. gåsemad (Arabidopsis thaliana), men desværre bibeholder planterne ikke genet i flere generationer. Så også her er der behov for yderligere udvikling, før vi får rekombinante planter, der kan dyrkes om vinteren eller i kolde egne.